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        新聞中心

        PCR應用中存在的問題,實驗人了解一下

        發布時間:2022-01-05瀏覽次數:172返回列表

          開展 PCR 應具有一定的條件。需要一個正規的 pCR 實驗室,采集標本、核酸提取、擴增及產物分析應在不同的房間進行;需有嚴密的防污染措施、假陽性和假陰性結果的質控等。實驗者應具有一定的分子生物學理論知識及實驗技能,能夠及時發現和糾正實驗中的問題。目前,我國在 PCR 應用中尤其是在臨床診斷中存在問題較多,主要表現為: PCR 試劑的考核、審查工作薄弱,許多單位實驗條件不符合要求,部分操作人員的理論和實驗知識水平較低。 PCR 的應用范圍過寬等,因此造成 PCR 實驗結果的可靠性差,出現較多的假陽性、假陰性結果。



          一、假陽性:

          實驗中設立的陰性對照可提示有無假陽性結果出現。如果一次實驗中的幾個陰性對照中出現一個或幾個陽性結果,提示本次實驗中其它標本的檢測結果可能有假陽性。造成假陽性的原因包括樣品污染、擴增試劑污染、擴增產物交叉污染等。常見的污染來源包括實驗室環境、加樣器、操作中形成的噴霧、 DNA 抽提儀器、試劑及任何與擴增產物接觸的東西。預防措施:(1)工作區隔離。(2)改進實驗操作,如在加樣過程中避免試劑飛濺、吸頭離心管使用前高壓處理、試劑分裝成小份一次使用后棄去等。(3)操作程序合理化,如后加陽性對照等。

          交叉污染的處理方法: 交叉污染指擴增產物對將要擴增的樣品或反應管的污染。由于 PCR 的敏感性和效率特別高,所以少量的擴增產物污染標本或反應管即可出現假陽性。交叉污染的處理方法包括 :

          1 .在 DNA 模板和多聚酶加入前,紫外線照射反應管內容物以破壞污染的 PCR 產物。一般選用波長 254nm 照射 30min ( Nature , 1990 , 34:27 )

          2 . PCR 實驗中使用 dUTP ,而不用 dTTP 。在擴增前使用 UraciI N 一 g1ycosylase (尿嘧啶糖基化酶)處理可降解交叉污染的 PCR 產物,而不降解基困組 DNA 模板,然后熱滅活此酶,再進行擴增反應( Gene , 1990 , 93 : 125 )。美國 PE 公司提供此類試劑盒( PCR carry-over preventionkit 。

          3 .在 PCR 反應前加入一種光化學試劑,反應完成后激活該試劑,光化學試劑可交聯 DNA 鏈,使之不能再擴增( Nucleic Acids Res , 1991 , 19 : 99 )。

          二、假陰性:

          如果實驗中設置的陽性對照未能擴增成陽性結果,提示本次實驗中可能有假陰性結果。但這里應注意,許多國產 PCR 試劑盒中陽性對照采用質粒 DNA ,和標本相比來說,不需純化提取核酸的步驟,因此,如果在標本核酸純化提取步驟有問題,即使陽性對照均呈陽性,標本檢測中還可能有假陰性。

          造成假陰性的原因包括: (1) DNA 抽提過程不當。 (2) DNA 樣品中含有 Taq 聚合酶抑制劑,如尿素、 DMSO 、 SDS 等物質,可抑制 Taq 酶活性, DNA 樣品中的蛋白質和重金屬離子等亦影響 Taq 酶活性,尤其是含有較多膿液或分泌物的標本,其中雖有待查菌,但卻因標本處理不當而出現假陰性 。

          設置內對照是判斷假陰性較好的指示系統。在每一反應管中加入內對照,若內對照未能擴增出來,說明該反應管的結果可能有問題。

          三、PCR產物的鑒定

          PCR 產物通過瓊脂糖凝膠電泳可判斷其長度是否為預期的長度,但只有通過雜交試驗或序列分析等才能判斷其特異性。嚴格說來, PCR 產物均應通過實驗證實其特異性。在我國一些科研論文和臨床檢測中缺乏這一環節。

          綜上所述, PCR 具有其優點,但也有不足之處,它是一種很好的科研手段,但作為常規診斷方法尚需進一步改進和提高。目前的關鍵問題是如何正確應用 PCR 。雖然 PCR 尚未在包括美國等發達國家作為常規診斷方法,但如果具備開展 PCR 需要的條件, PCR 是可作為輔助診斷手段使用的。目前,只有針對 PCR 應用中存在的問題,采取措施,正確應用 PCR ,才能使這一技術在科研和臨床工作中發揮應有的作用

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